La temporada comienza en la misma escena del último episodio de la cuarta temporada, Sydney Bristow y Michael Vaughn en el coche camino de sus vacaciones. Tras el accidente Sydney queda inconsciente, cuando se recupera ha llegado ya la ambulancia y la policía. Se llevan a Vaughn y ella se queda en el coche y ve como un 'policía' va a ponerle una inyección. Huye por un campo de maíz mientras la persiguen. Vuelve al coche y ve como un helicóptero se lleva a Vaughn. Sydney vuelve a Los Ángeles y Vaughn está desaparecido. Al investigar acerca del pasado de Vaughn, sale a la luz una antigua organización de estudiosos de Rambaldi llamada Profeta Cinco, que resurge a raíz de los avances en la investigación sobre la obra de Rambaldi efectuada en los últimos años por Sydney, Sloane y Elena Derevko.

Dos de los nuevos personajes están directamente relacionados con Profeta Cinco: por una parte Renée Rienne, quien lleva estudiando la organización junto a Vaughn desde hace años, Rachel Gibson, agente de una de las células terroristas de Profeta Cinco denominada "La Cabaña" y que cree que trabaja para el gobierno, y por último Kelly Peyton, una agente de Profeta Cinco que va ganando importancia con el transcurso de los acontecimientos. Al equipo de APO también se une Thomas Grace, un agente de la CIA que realiza su propia investigación a espaldas de los demás. Se descubre por qué Vaughn llevó el caso de Sydney cuando ella llegó a la CIA, así como la relación de la madre de Sydney con Vaughn. Durante el rodaje de la quinta temporada la actriz Jennifer Garner queda embarazada, una experiencia que comparte con su personaje.

La trama de esta última temporada hace referencia directa a los acontecimientos de las anteriores, de forma que en su transcurso reaparecerán la mayoría de personajes importantes en la serie. Además cierra la trama principal y da respuestas a cuestiones que habían quedado en el aire.